Luận án Nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa Ribosome của một số loài sán lá ruột thuộc họ Heterophyidae ký sinh gây bệnh trên người và động vật tại Việt Nam

ViÖN HµN L¢M khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam 
ViÖn c«ng nghÖ sinh häc 
L£ THÞ VIÖT Hµ 
NGHIÊN CỨU C I M HỆ GEN TY TH V 
 N V M H I O OME CỦ MỘT 
LOÀI ÁN LÁ UỘT THUỘC H 
HETEROPHYIDAE KÝ INH GÂY ỆNH T ÊN 
NGƯỜI V ỘNG VẬT TẠI VIỆT N M 
LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc 
Hµ néi - 2021 
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
LÊ THỊ VIỆT HÀ 
 NGHIÊN CỨU C I M HỆ GEN TY TH VÀ 
 N VỊ M H RI OSOME CỦ MỘT S 
LOÀI SÁN LÁ RUỘT THUỘC HỌ 
HETEROPHYIDAE KÝ SINH GÂY ỆNH TRÊN 
NGƯỜI VÀ ỘNG VẬT TẠI VIỆT N M 
Chuyên ngành: Hóa sinh học 
Mã số: 9 42 01 16 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Lê Thanh Hòa 
 Viện Công nghệ sinh học 
2. PGS.TS. ồng Văn Quyền 
Viện Công nghệ sinh học 
Hà Nội, 2021 
i 
 M ƠN 
 t t s u s hất đ GS.TS. Lê Thanh Hoà, nguyên 
 rưở Ph M ễ dị h, V ệ C hệ s h họ , V ệ H m Khoa họ v 
C hệ V ệt Nam, th o th s t m hu t đ t t h tr t p hư d , 
dành h u th a tru đ t th , t o mọ đ u ệ thu ợ , trao đ , đị h 
hư , đ v v p đ t tro qu tr h h u, họ t p v ho th h 
 u 
 t t s u s đ PGS.TS Đồ Vă Qu , Phó V ệ 
V ệ trưở V ệ C hệ s h họ , V ệ H m Khoa họ v C hệ V ệt 
Nam, th đồ hư d hoa họ đ t t h hỉ ảo t tro th a họ t p 
v h u 
 ảm h th h hất t t p thể h u Phòng 
M ễ dị h họ - V ệ C hệ s h họ - V ệ H m Khoa họ v C hệ 
V ệt Nam đ h ệt t h p đ t ho th h u ủa m h 
 đượ ảm : 
- Ba h đ o V ệ C hệ s h họ , V ệ H m Khoa họ v C 
 hệ V ệt Nam đ t o đ u ệ ho t đượ họ t p v h u 
- Ba G m đố Họ v ệ Y–Dượ họ tru V ệt Nam, PGS S Ph m 
Quố B h, Chủ tị h H đồ rư v , đồ h ệp ủa B m , 
Phòng, Khoa ủa Họ v ệ đ t o đ u ệ p đ t tro suốt qu tr h họ t p 
- C m s hỗ trợ h phí ủa Quỹ Ph t tr ể Khoa họ v hệ Quố 
 a (NAFOS ED) tro đ t m số 1 - 1 v 108.02-2017.09 do GS S 
 ha h H a hủ h ệm. 
- S Đỗ ru Dũ , rưở Khoa K s h tr , V ệ Sốt r t-Ký sinh 
trùng-C tr ru ư v đồ h ệp trong Khoa đ p đ t h 
th h ệ v ệ thu m u, thí h ệm h u h h th họ cho nghiên 
 u 
ii 
Cuố t t t s u s đ ư th , a đ h đ 
 u u hu hí h, đ v , p đ ũ hư h a s h h hă v 
tru h ệt hu t p t ho th h qu tr h họ t p v h u ủa m h 
 ê hị V ệt Hà 
iii 
LỜI CAM KẾT 
Tôi xin cam đoan: 
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các 
cộng sự khác; 
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã 
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép 
của các đồng tác giả; 
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2021 
Tác giả 
iv 
 MỤC LỤC 
 Trang 
Lời cảm ơn ....................................................................................................... i 
Lời cam kết ....................................................................................................... iii 
Mục lục ............................................................................................................. iv 
Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................ ix 
Danh mục các bảng .......................................................................................... xii 
Danh mục các hình ........................................................................................... xiv 
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 3 
1. 1. Tình hình nghiên cứu sán lá ruột nhỏ h Heterophyidae thuộc 
lớp Sán lá Trematoda ................................................................... 
3 
1.1.1. Phân loại sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae ................................... 3 
1.1.2. Đặc điểm sinh học và phân b c a sán lá ruột nhỏ họ 
Heterophyidae ................................................................................. 
6 
1.1.3. Tình hình nghiên cứu sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae trên thế 
gi i v ở Việt Nam .......................................................................... 
11 
1.2. T th , ribosome t th v c i m h gen t th ................... 17 
1.2.1. Gi i thiệu ty thể c a động vật ......................................................... 17 
1.2.2. ibosome c a ty thể .................................................................. 21 
1.2.3. Cấu trúc v sắp xếp gen ở hệ gen ty thể .......................................... 21 
1.2.4. Đặc điểm gen v v ng kh ng m h a ở hệ gen ty thể .................... 23 
1.2.5. Nghiên cứu ứng dụng gen v hệ gen ty thể ..................................... 29 
1.3. Giới thi u Ribosome c a t o v n v m h a ri osome .... 31 
1.3.1. Gi i thiệu ribosome c a tế b o ....................................................... 31 
1.3.2. Đơn v m h a ribosome ............................................................ 33 
1.3.3. Nghiên cứu ứng dụng ch th phân t c a đơn v m h a 
ribosome ................................................................................. 
37 
v 
1.4. ngh a v s c n thi t nghiên cứu c i m mtDNA v n 
v m h a ri osome c a sán lá ruột nhỏ Haplorchis c a t i 
40 
CHƯƠNG 2. Đ I TƯ NG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU  
43 
2.1. Đ i t ng v t li u a i m nghiên cứu  43 
2.1.1. Đ i t ng v vật liệu nghiên cứu  43 
2.1.2. M u nghiên cứu c a các lo i thuộc họ Heterophyidae ... 43 
2.1.3. Đ a điểm v thời gian nghiên cứu ................................................... 45 
2.2. Ph ng pháp ti p c n v tr nghiên cứu  45 
2.3. Ph ng pháp nghiên cứu h gen t th ... 47 
2.3.1. Ph ơng pháp xác đ nh cấu trúc v sắp xếp hệ gen ty thể c a sán lá 
ruột nhỏ Haplorchis taichui  
47 
2.3.2. Ph ơng pháp phân t ch đặc điểm gen N ribosome (MRG) ty 
thể  
48 
2.3.3. Ph ơng pháp phân t ch đặc điểm gen N vận chuyển t N ty 
thể  
48 
2.3.4. Ph ơng pháp phân t ch v ng kh ng m h a ở hệ gen ty thể .. 49 
2.3.5. Phân t ch ph ơng thức s dụng nucleotide v t nh toán giá tr độ 
lệch skew skewness trong hệ gen ty thể ... 
49 
2.3.6. Phân tích đặc điểm gen m h a protein v s thiên v s dụng 
bộ m ... 
50 
2.3.7. Ph ơng pháp t nh toán khoảng cách di truy n c a các lo i sán lá 
ruột nhỏ d a trên cộng h p 3 gen cob+nad1+cox1  
50 
2.3.8. Ph ơng pháp t nh toán khoảng cách di truy n c a các lo i sán lá 
ruột nhỏ d a trên cộng h p 12 PCG c a ty thể ... 
51 
2.3.9. Ph ơng pháp phân t ch phả hệ d a trên ch th cộng h p ba gen 
PCG c a ty thể (cob+nad1+cox1) ... 
51 
2.3.10. Ph ơng pháp phân t ch phả hệ d a trên ch th cộng h p to n bộ 
12 PCG c a ty thể ... 
52 
2.4. Ph ng pháp nghiên cứu n v mã hóa ribosome (rTU) ........ 53 
vi 
2.4.1. Ph ơng pháp xác đ nh cấu trúc v sắp xếp gen v ng giao gen c a 
đơn v m h a ribosome .. 
53 
2.4.2. Ph ơng pháp xác đ nh độ d i v đặc điểm gen r N v v ng 
giao gen ở đơn v m h a ribosome ................................................ 
53 
2.4.3. Ph ơng pháp phân t ch ph ơng thức s dụng nucleotide và tính 
toán giá tr độ lệch skew trong đơn v m h a ribosome .. 
54 
2.4.4. Ph ơng pháp phân tích t ơng đ ng nucleotide c a các gen r N 
v ph n m h a ribosome c a sán lá ruột nhỏ họ eterophyidae ... 
54 
2.4.5. Ph ơng pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai gen r N 
ribosome (5.8S, 18S, 28S rRNA)  
55 
2.4.6. Ph ơng pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai v ng giao gen 
ITS (ITS-1, ITS-2) .. 
56 
2.4.7. Ph ơng pháp phân tích phả hệ c a H. taichui v H. pumilio d a 
trên chu i gen 28S rRNA to n ph n  
56 
2.4.8. Ph ơng pháp phân tích phả hệ c a H. taichui v H. pumilio d a 
trên cộng h p gen (18S+28S rRNA) to n ph n 
57 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU . 58 
3.1 K t qu nghiên cứu h gen t th loài Haplorchis taichui m u 
Vi t Nam ............................................................ 
58 
3.1.1. Cấu trúc v sắp xếp hệ gen ty thể c a sán lá ruột nhỏ Haplorchis 
taichui ............................................................................................. 
58 
3.1.2. Phân t ch đặc điểm gen N ribosome c a ty thể . 62 
3.1.3. Đặc điểm gen N vận chuyển t N c a ty thể  63 
3.1.4. Đặc điểm v ng kh ng m h a ở mtDNA c a sán lá ruột nhỏ 
Haplorchis taichui .. 
65 
3.1.5. Ph ơng thức s dụng nucleotide v giá tr độ lệch skew trong 
hệ gen ty thể  
65 
3.1.6. Phân t ch đặc điểm gen m h a protein v thiên v s dụng bộ 
m (codon usage)  
66 
vii 
3.1.7 . Khoảng cách di truy n giữa Haplorchis taichui v các lo i sán lá 
khác ở họ eterophyidae v Opisthorchiidae d a trên cộng h p 
amino acid c a ba gen (cob+nad1+cox1) ... 
68 
3.1.8. Khoảng cách di truy n giữa Haplorchis taichui v các lo i sán lá 
khác ở họ eterophyidae v Opisthorchiidae d a trên cộng h p 
amino acid c a 12 PCG ... 
70 
3.1.9. Phân t ch phả hệ sán lá ruột nhỏ d a trên chu i amino acid cộng 
h p c a ba gen m h a protein (cob+nad1+cox1) .. 
72 
3.1.10. Phân t ch phả hệ sán lá ruột nhỏ d a trên chu i amino acid cộng 
h p c a to n bộ 12 gen m h a protein .. 
74 
3.2. K t qu nghiên cứu n v m h a ri osome loài Haplorchis 
taichui v lo i H. pumilio m u Vi t Nam  
77 
3.2.1. Cấu trúc v sắp xếp gen c a đơn v mã hóa ribosome c a 
Haplorchis taichui  
77 
3.2.2. Độ d i gen r N v v ng giao gen ở đơn v m h a ribosome 
c a các lo i Haplorchis taichui v Haplorchis pumilio .................. 
80 
3.2.3. Đặc điểm cấu trúc bậc hai gen r N . 1 2 r N ... 81 
3.2.4. Đặc điểm cấu trúc v ng giao gen T T -1, ITS-2)  86 
3.2.5. ết quả phân t ch ph ơng thức s dụng nucleotide trong đơn v 
m h a ribosome . 
88 
3.2.6. ết quả phân t ch t ơng đ ng nucleotide c a các gen r N v 
ph n m h a ribosome c a sán lá ruột nhỏ họ eterophyidae ... 
90 
3.2.7. Phân t ch phả hệ c a H. taichui v H. pumilio d a trên chu i 
nucleotide gen 2 ribosome to n ph n . 
91 
3.2.8. Phân t ch phả hệ c a H. taichui v H. pumilio d a trên cộng h p 
to n ph n hai gen rRNA (18S+28S rRNA)  
94 
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ .. 97 
4.1. V nghiên cứu h gen t th sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui 99 
viii 
4.1.1. V thu nhận dữ liệu gen học hệ gen ty thể .. 99 
4.1.2. V đặc điểm hệ gen ty thể c a sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui 100 
4.1.3. V một s ứng dụng mtDN trong nghiên cứu di truy n v phả 
hệ . 
104 
4.1.4. V đ ng g p cung cấp cơ sở dữ liệu hệ gen ty thể . 107 
4.2. V nghiên cứu n v m h a ri osome H.taichui v H. 
pumilio  
109 
4.2.1. V thu nhận dữ liệu gen học đơn v m h a ribosome  109 
4.2.2. V đặc điểm đơn v m h a ribosome c a sán lá ruột nhỏ 
Haplorchis taichui v H. pumilio  
110 
4.2.3. V một s ứng dụng rTU trong nghiên cứu di truy n v phả hệ  113 
4.2.4. V đ ng g p cung cấp cơ sở dữ liệu đơn v m h a ribosome ... 116 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 119 
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG B LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ..... 121 
TÓM TẮT BẰNG TIẾNG ANH ................................................................... 122 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 130 
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 1 
ix 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VI ... t ê t t cả mồi ư c sử dụng ể thu sản phẩm PCR ch 
15 
thư c hác nhau Trên c s trình tự nucleotide của các chu i thu nhận, ti p 
tục thi t mồi và giải trình tự bằng phư ng pháp ti p lồng vào nhau, hay còn 
g i là phư ng pháp “l o m ” trực ti p từ sản phẩm ho c và sau hi tách dòng. 
Giải trình tự ư c thực hiện t i các c s d ch vụ: Macrogen (Hàn Quốc) t i 
(https://www.macrogen.com/en/main/); và Công ty Nam Khoa (Việt Nam): 
( 
 Mồi sử dụng ể thu nhận rTU của H. taichui và H. pumilio của Việt Nam 
(Bảng PL2 4) ư c thừa từ các nghiên cứu trư c y và ư c thi t bổ sung 
dựa trên một số công bố v rTU c trên Ng n hàng gen ho c d liệu của 
ch ng tôi công bố và hiện ang c (Le et al., 2017; 2020b) ho c ư c sưu t m ể 
 t h p sử dụng (Olson et al., 2003; Tkach et al., 2016). PCR LPCR ư c áp 
dụng phối h p các c p mồi hác nhau và lệch nhau ể thu các ph n DN (ph n 
 o n) dài ng n hác nhau 
Toàn bộ m i n v rTU (5 8S-ITS -5 8S-ITS2-28S-IGS 3 ) của sán lá, 
 ư c bi t cho n nay c ộ dài hoảng từ 7–8 cho n 9– b, t y thuộc m i 
loài Ph n m h a (coding region) ư c t nh từ u 5 của gen 8S cho n h t 
 u 3 của gen 28S, ộ dài thư ng là hoảng 6–7 ho c 8 b, dài ng n hác nhau 
Các gen 8S, 5 8S, 28S rRN c bản c ộ dài cố nh các loài trong một chi, 
thậm ch trong một h Tuy nhiên, v ng ITS- (gi a gen 8S và gen 5 8S) và 
ITS-2 (gi a gen 5 8S và gen 28S) và v ng bản l IGS, một số loài c thể c 
nhi u c u tr c l p li n c số lư ng hác nhau, nên tổng ch thư c s hác 
nhau C một số mẫu chỉ thu ư c và giải trình tự ư c toàn bộ ph n m h a, 
 hông thu ư c v ng bản l (IGS) 
PL2.4. n p n p n ứng t n P v m t s n p m 
Phản ứng PCR c thể i u chỉnh thành ph n và chu trình nhiệt ph h p ể 
thu sản phẩm PCR tốt nh t c thể thu nhận các ph n o n của mtDN và của 
rTU Ch ng tôi gi i thiệu phản ứng c hiệu su t tốt nh t ư c thực hiện 
Phản ứng c tổng thể t ch 5 µL, gồm: 25 µL PCR mastermi (Thermo 
Fisher Scientific, MA, USA), 2 µL m i lo i mồi ( pmol µL), 2 µL huôn DN 
(25–5 ng µL), 2 µL DMSO (dimethyl sulfo ide) và 7 µL nư c hử ion DEPC, 
 ư c thực hiện trên máy MJ PTC- (US ) Chu trình nhiệt gồm: chu ỳ 
16 
95
oC 5 ph t, 35 chu ỳ [94oC/1 phút, 52oC/1 phút; 72oC/2–6 ph t], chu ỳ 
cuối 72oC/10 phút. 
Phản ứng L-PCR ư c thực hiện v i en yme Phusion DN polymerase 
(Thermo Fisher Scientific Inc ), sản phẩm thu ư c c ộ dài 4–6 b v i ch t 
lư ng tốt 
Sản phẩm PCR LPCR thu ư c ư c iện di iểm tra trên th ch agarose 
 % nhuộm ethidium bromide, so sánh ộ dài v i chỉ th DN Lamda (HindIII). 
Sản phẩm PCR n b ng ư c tinh s ch trực ti p bằng bộ sinh phẩm GeneJET 
PCR Purification Kit (Thermo Scientific Inc ) V i sản phẩm a b ng, thì b ng 
DN ng ch thư c dự t nh ư c ph n lập từ th ch agarose bằng bộ sinh phẩm 
GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific Inc.). Các sản phẩm PCR ư c 
tinh s ch bằng bộ sinh phẩm GeneJET PCR Purification Kit và ư c gửi i 
giải trình tự t i các c s d ch vụ gi i thiệu 
PL2.5. P ương p áp tá dòng t u DNA pl sm d tá tổ ợp 
 Sản phẩm PCR ho c ư c giải trình tự trực ti p, n u c ch t lư ng tốt và 
hàm lư ng ủ theo yêu c u Một số sản phẩm ư c tách dòng sử dụng vector T 
cloning thư ng m i là pCR2 TOPO (Invitrogen) ho c TOPO XL PCR 
Cloning Kit (Invitrogen Inc) (n u sản phẩm PCR <2 b, nhi u trư ng h p 2 
 b, cho n 4 b), ch n l c plasmid tái tổ h p ể giải trình tự DN của plasmid 
tái tổ h p ư c tách chi t v i bộ hoá ch t GeneJET Plasmid Miniprep Kit 
(Thermo Fisher Scientific Inc.). 
 n p m PCR vào pl m vector: Do sản phẩm PCR (sử dụng 
enzyme Taq DNA polymerase) thông thư ng ư c g n thêm denine ( ) u 
3 , nên hi nối v i vector c u lồi là Thymine (T) ư c các h ng sinh phẩm 
thi t từ trư c, thì hai nucleotide này s g n nối bổ sung cho nhau nh en yme 
nối T4-DN ligase ho c en yme topoisomerase (Hình PL2 ) 
V tr ể nối sản phẩm PCR vào ư c bố tr trong chu i gen lacZ, gen 
mã h a và sản u t en yme β-galactosidase, c tác dụng c tác thủy ph n một 
lo i h a ch t c tên g i là X-gal ể t o nên các dẫn ch t c màu anh Vi huẩn 
 hông mang plasmid tái tổ h p s t o nên huẩn l c màu anh Khi sản phẩm 
 ư c nối vào v tr nối thành công, thì o n DN ngo i lai làm b t ho t gen lacZ 
17 
 hông cho n sản u t ra en yme β-galactosidase, và do vậy, vi huẩn mang 
plasmid tái tổ h p s hông c en yme β-galactosidase ph n hủy c ch t X-gal 
và huẩn l c s mang màu tr ng hi nuôi trên môi trư ng c chứa X-gal. 
Hình PL2 C u tr c của vector pCR®2 TOPO (Invitrogen Inc ) c u lồi T 
(Thymine) ể ti p nhận và g n sản phẩm PCR c u lồi ( denine) nh en yme 
TOPO. 
T àn p ần p n ứn Vector pCR2.1TOPO: 1 µL 
Nư c tinh hi t: 1 µL 
 Sản phẩm PCR: 3 µL 
 Dung d ch muối: 1 µL 
 Tổng số: 6 µL 
C n n p và n n T bào sử dụng ể chuyển n p là t bào 
 hả bi n (competent cells) E. coli chủng DH5αT ho c Top (Invitrogen) L y 
2–3 µL sản phẩm của phản ứng nối-gh p, chuyển vào ống chứa 5 µL ho c 
µL t bào hả bi n DH5αT ; Ủ trên á trong 45 ph t, ử l nhiệt (heat-shoc ) 
42
o
C/45 giây và lập tức chuyển vào trong á và ể 2 ph t Thêm 5 µL dung 
d ch SOC (dung d ch giàu dinh dưỡng), l c 2 vòng ph t 37oC gi 3 ph t; 
rồi ti p tục l y toàn bộ h n h p dàn trên m t th ch (LB agar ,5%) c chứa 
kháng sinh Kanamycin (hay Ampicillin) và X-gal và ủ tủ m 37oC trong 18–20 
gi Sau hi ủ, n u c huẩn l c phát triển trên m t th ch (sau 8–2 gi ), thì ưa 
 ĩa th ch vào hoang l nh ( oC) trong tủ l nh ể X-gal ư c ph n giải hoàn toàn, 
gi p nhận bi t d dàng huẩn l c tr ng và anh trong quá trình ch n l c huẩn l c 
C ọn lọ k n l và n on m ườn lỏn Ch n l y một số 
 huẩn l c màu tr ng (4–6 huẩn l c) ể nuôi c y trong các ống chứa môi trư ng 
LB lỏng c háng sinh Kanamycin ( µL Kanamycin (5 mg ml) cho ống LB 
18 
nuôi c y) Ch n huẩn l c màu tr ng ngà là tốt nh t Bổ sung thêm 7 µL X-gal 
(4 mg ml) vào môi trư ng ể ph n biệt vi huẩn tái tổ h p phát triển ( hông c 
màu anh) và lo i bỏ vi huẩn hông tái tổ h p (ống c màu anh) Sau hi c y 
 huẩn l c, ống môi trư ng ư c l c 22 vòng ph t trong 6–2 gi 37oC cho 
vi huẩn nhân lên. 
T pl m ợp Sử dụng bộ it QI prep Spin 
Miniprep của h ng QI GEN theo hư ng dẫn của nhà sản u t 
- L y ,5 mL dung d ch t bào vi huẩn tái tổ h p ư c nuôi c y qua 
 êm, ly t m vòng ph t trong 4–5 ph t ể thu c n t bào Thêm 25 µL 
dung d ch P ể hòa tan c n, h t nh nhàng lên uống vài l n rồi cho ti p 25 
µL dung d ch P2; ể nhiệt ộ phòng trong 3–4 phút. 
- Thêm 35 µL dung d ch N3, trộn nh ; ly t m 3 vòng ph t trong 
ph t Thu d ch trong bên trên ( 8 µL) cho lên trên b m t màng của cột l c t 
trong ống hứng (collection tube); ly t m 3 vòng ph t trong ph t, bỏ 
d ch bên dư i 
- Thêm 5 µL dung d ch PB lên trên màng l c ể rửa màng l c c DN của 
plasmid; ly tâm 13.000 vòng ph t trong ph t, bỏ ph n d ch bên dư i 
- Thêm 75 µL dung d ch PE lên trên màng l c ể ti p tục rửa màng l c; 
ly t m 3 vòng ph t trong ph t, bỏ ph n d ch bên dư i 
- Cuối c ng, ly t m ti p 3 vòng ph t trong ph t cho màng chứa 
DN của plasmid tái tổ h p thật hô, bỏ ph n d ch bên dư i Chuyển cột l c 
sang ống Eppendorf m i và thêm 5 µL dung d ch EB lên trên màng l c, ể 
nhiệt ộ phòng 3–4 phút. 
- Ly t m 3 vòng ph t trong –2 ph t DN của plasmid tái tổ h p 
 ư c “thôi” ra c ng v i dung d ch EB (5 µL) và thu DN của plasmid tái tổ 
h p trong ống, hiệu và bảo quản –20oC cho n hi sử dụng 
C k m ợp L y L DN plasmid tái tổ h p, d ng 
en yme gi i h n EcoRI c t DN plasmid, ủ 37oC trong 2 gi ; iện di trên th ch 
agarose % và iểm tra ộ dài của các b ng thu ư c ể t nh toán ộ dài của sản 
phẩm PCR ngo i lai c trong plasmid vector Sản phẩm DN plasmid tái tổ h p 
19 
giải trình tự sử dụng mồi chung M 3F (5 - GT CG CGGCC G-3 ) ho c 
M13R (5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´). 
PL2.6. P ương p áp g t n t v xử lý uỗ nu l ot d 
 Sản phẩm PCR ng n (< ,2– ,3 b) ư c giải trình tự trực ti p bằng mồi 
 uôi và mồi ngư c bám vào hai u biên (flan ing primers) cũng ch nh là c p 
primer ư c sử dụng thực hiện phản ứng PCR t o nên sản phẩm Trong 
trư ng h p giải trình tự v i sản phẩm PCR dài ( ,3 b, n vài b), n u sản 
phẩm c ch t lư ng n nh t, r , tốt, ngoài c p mồi hai u biên tham gia giải 
trình tự, ch ng tôi thi t các mồi ti p cho chu i sau lồng bám vào chu i 
trư c (g i là “l o m ”, “primer-walking” strategy) (Le et al., 2 7) ể thu chu i 
hai chi u V i o n DN ch n vào plasmid tái tổ h p, sử dụng mồi chung 
M13F (5 -GT CG CGGCC G-3 ) và M 3R (5 -
C GG C GCT TG C-3 ), ho c các mồi ư c thi t thêm bên trong 
(internal primers) ể giải trình tự Chu i nucleotide s c p do c s d ch vụ cung 
c p ư c biên tập (editing) từ giản ồ trình tự (chromatogram) ể thu chu i thứ 
c p bằng chư ng trình ChromasPro 
( sau s p p và thu chu i cuối 
c ng bằng chư ng trình GENEDOC 2 7 ( 
Ph n t ch phả hệ bằng chư ng trình MEG 7 ho c MEG X 
(https://www.megasoftware.net/) sử dụng phư ng pháp ”k n l n k ” 
(Neighbor-Joining, NJ) ho c ” p n ” (Ma imum li elihood, ML) v i 
hệ số tin cậy (bootstrap) l n l p l i (Kumar et al., 2016; 2018). 
PL2.7. P ương p áp t u p t u t p uỗ so sán v s p xếp n n 
 Sau hi c chu i cuối c ng, việc u tiên là ác nh chu i c ng 
chu i của loài ang c n hông Việc giám nh chu i ư c thực hiện bằng cách 
truy cập vào Ng n hàng gen sử dụng chư ng trình BL ST 
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ể em t thu nhận các chu i tư ng 
ứng c ng và hác loài chi h ể so sánh ối chi u Nhi u trư ng h p, chu i ư c 
giám nh bằng cách so sánh v i các chu i trong ho d liệu của ch ng tôi (D 
liệu các loài sán d t) 
20 
 Một số lư ng vài chục chu i (n u c ) của các chủng loài g n gũi và của 
các chủng loài trong các chi h liên h ph n bộ tư ng ứng ư c thu nhận từ m i 
nguồn ể sử dụng s p p c n chỉnh (alignment) S p p c n chỉnh c thể thực 
hiện trực tuy n (online) qua chư ng trình Gene Infinity 
( ho c các chư ng trình so sánh chu i c t i trang 
Web Expasy (https://www.expasy.org/) Tuy nhiên ch ng tôi sử dụng chư ng 
trình GENEDOC 2 7 và MEG 7 ho c MEG X Từng trư ng h p sử dụng s 
 ư c gi i thiệu chi ti t các mục tư ng ứng 
PL2.8. P ương p áp t u n n DNA osom á lo sán lá u t n 
 L-PCR ư c áp dụng thu nhận toàn bộ ho c một ph n ba ( 3) n một 
nửa ( ) v ng sao ch p rTU ( ộ dài hoảng 3 b n 4–5 b, ho c c thể n 6 
 b cho m i sản phẩm) Các sản phẩm c ch thư c dự t nh và c ch t lư ng tốt 
(r , ậm trên th ch agarose) ư c ti p tục sử dụng giải trình tự trực ti p từ hai 
 u biên ho c và làm huôn cho PCR LPCR m i bên trong ể c sản phẩm 
ti p tục giải trình tự 
 Ph n l n sản phẩm PCR ư c giải trình tự trực ti p sau hi tinh s ch sử 
dụng bộ sinh phẩm GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific Inc., MA, 
US ) theo hư ng dẫn của nhà sản u t. Chu i nucleotide của từng ph n o n 
sau hi biên tập (editing) bằng chư ng trình ChromasPro, ư c lồng nối liên ti p 
v i nhau ể thu nhận hoàn toàn trình tự rTU của m i loài Sử dụng chu i 
nucleotide biên tập cuối c ng ể ác nh gen, ph n t ch c u tr c, s p p gen, 
v ng biên, c iểm chu i nucleotide nội gen và vùng giao gen. Các chư ng 
trình ChromasPro, BioEdit, GENEDOC2 7 ư c sử dụng ể thu nhận, ử l , 
ph n t ch các chu i nucleotide, c iểm các gen ribosome ( 8S, 5 8S, 28S) và 
v ng giao gen gồm ITS-1 và ITS-2 và v ng bản l IGS