Tóm tắt Luận án Nghiên cứu một số Locus đa hình STR ở người Việt Nam nhằm sử dụng trong khoa học hình sự, nhận dạng cá thể và xác định huyết thống

 MỞ ĐẦU 
 Công nghệ phân tích ADN trong sử dụng các locus STR hiện 
nay đã trở thành công cụ đắc lực trong phân tích nhận dạng cá thể 
người và giám định huyết thống ở rất nhiều quốc gia khác nhau trên 
thế giới. Tại Việt Nam từ năm 1998 trở lại đây đã có sự phát triển 
mạnh mẽ và nhanh chóng về trình độ cũng như khả năng ứng dụng 
kỹ thuật phân tích ADN sử dụng hệ các locus STR. Đã có nhiều 
nghiên cứu về hệ các locus STR trên nhiễm sắc thể thường cũng như 
NST giới tính. Nhiều bộ KIT chuẩn sử dụng các locus STR được ứng 
dụng, các bộ KIT có thể sử dụng phù hợp với từng công nghệ khác 
nhau tuỳ thuộc vào điều kiện cụ thể của từng PTN. 
 Để chủ động trong công nghệ phân tích và phù hợp với điều kiện 
PTN tại Việt Nam, từ năm 2001 đến nay, Viện Kỹ thuật Hoá-Sinh và 
Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục Hậu cần - Kỹ thuật - Bộ Công an đã 
nghiên cứu chế tạo thành công KIT phân tích đa gen sử dụng 9 locus 
đa hình STR. Các kết quả nghiên cứu hiện nay đã và đang được ứng 
dụng tốt trong trong phân tích gen hình sự tại một số cơ sở giám định 
công an các địa phương như: Hà Nội, Hải Phòng, Thanh Hóa, Cần 
Thơ, Khánh Hòa... 
 Tuy nhiên, nếu chỉ dừng lại ở phân tích 9 gen thì thực tế cho thấy 
trong nhiều trường hợp giám định cụ thể, đặc biệt là đối với những 
ca giám định phức tạp (trường hợp giám định huyết thống xác định 
tội phạm tình dục có nghi can nhiều người mà những người này lại 
có quan hệ huyết thống, họ hàng...) vẫn chưa cho kết quả đáng tin 
cậy. 
 Do vậy, chúng tôi xác định việc mở rộng nghiên cứu để tăng số 
lượng locus là yêu cầu cần thiết, đồng thời cần có sự đánh giá tổng 
 1 
thể về tần suất phân bố của các locus STR ở quần thể người Việt để 
đưa ra được hướng ứng dụng phù hợp. Đề tài luận án “Nghiên cứu 
một số locus đa hình STR ở người Việt Nam nhằm sử dụng trong 
khoa học hình sự, nhận dạng cá thể và xác định huyết thống” được 
tiến hành với các mục tiêu sau: 
 1. Thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu để có thể nhân bản và 
 phân tích được tính đa hình một số locus STR chọn lọc bổ 
 sung (F13A01; D8S1179 và HPRTB). 
 2. Xây dựng thang alen chuẩn cho các locus F13A01; D8S1179 
 và HPRTB. 
 3. Điều tra, khảo sát tính đa hình và xác định được tần số phân 
 bố các alen thuộc 15 locus STR của người Việt (D5S1358, 
 D7S820, D13S317, CSF1PO, TH01, TPOX, D16S539, 
 D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01; D8S1179 
 và HPRTB) 
 4. Đánh giá và đề xuất được các locus STR định hướng ứng 
 dụng trong nhận dạng cá thể và xác định huyết thống phù 
 hợp với người Việt Nam. 
 Ý NGHĨA THỰC TIỄN VÀ 
 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 
 - Nghiên cứu xây dựng được điều kiện tối ưu để phân tích tổ 
 hợp 4 locus đa hình mới F13A01, D8S1179, HPRTB và 
 Amelogenin có thể nhân bội đồng thời trong cùng một phản 
 ứng. Bổ sung cho các tổ hợp locus đã nghiên cứu, góp phần 
 2 
 làm tăng độ chính xác trong phân tích nhận dạng cá thể 
 người và giám định huyết thống phù hợp với điều kiện PTN 
 tại Việt Nam. 
 - Bổ sung số liệu khảo sát tần suất alen 15 locus đa hình người 
 Việt, trong đó đã khảo sát mới 07 alen của locus F13A01 và 
 07 alen của locus HPRTB, phát hiện thêm được các alen mới 
 ở quần thể người Việt là alen số 8 của locus CSF1PO; alen 
 số 13 của locus vWA và alen số 15 của locus FES/FPS. 
 - Đánh giá được khả năng ứng dụng của 15 locus STR đối với 
 quần thể người Việt qua tính toán các chỉ số thống kê. 
 BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN 
 Luận án gồm 121 trang và 6 trang phụ lục, được bố cục như sau: 
mở đầu 4 trang; tồng quan 27 trang; vật liệu và phương pháp nghiên 
cứu 13 trang; kết quả và thảo luận 69 trang; kết luận, kiến nghị 2 
trang; danh mục các công trình khoa học đã công bố 1 trang. 
 3 
 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 
 1.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƢỜI 
 Các phương pháp giám định nhận dạng cá thể người được nghiên 
cứu từ trước tới nay bao gồm: 
 - Phương pháp hình thái học 
 - Nhận dạng cá thể bằng các yếu tố có bản chất protein (Xác 
 định nhóm máu, xác định một số nhóm protein và nhóm 
 enzym) 
 - Nhận dạng cá thể người qua phân tích ADN nhân và ADN 
 ty thể. 
 Việc sử dụng các phương pháp trong nhận dạng cá thể tuỳ thuộc 
vào loại mẫu, số lượng và chất lượng mẫu (bao gồm cả mẫu giám 
định nhận dạng và mẫu so sánh), số lượng cá thể cần nhận dạng, 
trang thiết bị của cơ sở giám định và trình độ chuyên môn của giám 
định viên. 
 Hiện nay, với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật 
và công nghệ, đặc biệt sau khi phát minh về phản ứng PCR ra đời, 
việc nhận dạng cá thể người bằng phương pháp phân tích ADN nhân 
trở thành công cụ đắc lực trong giám định bởi những ưu việt nổi bật 
của nó, đặc biệt phương pháp trở nên hữu dụng trong hình sự, khi mà 
các dấu vết thu được ở hiện trường còn lại rất ít hoặc đã bị biến tính, 
không thể tiến hành bằng các phương pháp nhận dạng truyền thống. 
 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH ADN 
ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƢỜI 
 Việc phân tích ADN trong nhận dạng hiện nay được tiến hành 
dựa trên một nguyên lý chung: ADN được tách ra khỏi tế bào (có 
trong mẫu sinh học thu được), sau đó các đoạn ADN được nhân lên 
 4 
bởi các cặp mồi đặc hiệu và sản phẩm nhân bội được phân tích bằng 
kỹ thuật điện di hay giải trình tự. Kết quả điện di sẽ được hiển thị 
nhờ hệ thống thiết bị phù hợp, cho biết kiểu gen cá thể cần phân tích. 
Các kỹ thuật được ứng dụng hiện nay bao gồm: 
 - Kỹ thuật PCR 
 - Kỹ thuật điện di 
 - Kỹ thuật giải trình tự 
 1.3. CÁC LOCUS STR TRONG HỆ GEN NGƢỜI VÀ ỨNG 
DỤNG CỦA CHÚNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ 
 Các đoạn ADN có cấu trúc lặp lại từ 2 – 6 bp được gọi là các 
đoạn lặp lại ngắn (STR). Các cấu trúc STR mang tính bảo thủ cao, 
được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cá thể . Các 
STR có thể được khuếch đại bằng phản ứng PCR. 
 Trong số các dạng lặp khác nhau của hệ STR, các đoạn lặp 4 
nucleotit được sử dụng phổ biến hơn các đoạn lặp 2 hoặc 3 nucleotit 
vì: 
- Khoảng kích thước giữa các alen nhỏ vừa phải phù hợp cho phản 
 ứng PCR phức. 
- Khoảng kích thước giữa các alen nhỏ vừa phải làm giảm khả 
 năng mất alen đối với các alen có kích thước nhỏ hơn. 
- Khả năng tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ thuận lợi 
 cho việc phân tích các mẫu ADN đã biến tính. 
- Việc giảm các sản phẩm “stutter” (băng giả) so với các 
 dinucleotit thuận lợi cho việc đọc kiểu gen đối với các mẫu lẫn. 
 5 
 CHƢƠNG 2. 
 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 
 2.1.1. Mẫu sinh phẩm 
 250 mẫu máu của các cá thể người Việt khỏe mạnh, không có 
 cùng quan hệ họ hàng (bao gồm 48 nữ và 202 nam) được thu tại 
 Hải Phòng và bảo quản trên thẻ bảo quản mẫu có tẩm hóa chất và 
 lưu giữ tại -20oC. 
 2.1.2. Các locus gen đa hình STR 
 Đề tài lựa chọn 15 locus gen đa hình STR bao gồm: locus 
 D5S818, D7S820, D13S317; CSF1PO, TPOX, TH01; D3S1358, 
 D16S539, vWA; F13A01, D8S1179; HPRTB; F13B; FES/FPS; 
 LPL và 01 locus xác định giới tính Amelogenin . 
 2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
- Phương pháp thiết kế mồi sử dụng các phần mềm thiết kế mồi 
 Primer Premier để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho các locus 
 STR F13A01, D8S1179 và HPRTB. 
- Phương pháp tách chiết ADN sử dụng Chelex. 
- Phương pháp PCR . 
- Phương pháp điện di và phân tích sản phẩm PCR trên gel 
 agarose và trên gel PA biến tính có ure. 
- Phương pháp chế tạo thang alen gồm các bước sau: 
 + Khảo sát, tìm kiếm các alen của locus nghiên cứu. 
 + Lựa chọn và tiến hành phản ứng PCR các kiểu gen có chứa các 
 alen cần thiết cho việc tạo thang alen của locus cần nghiên cứu. 
 + Tinh sạch alen. 
 + Xác định (định danh) alen theo quy ước quốc tế. 
 6 
 + Tạo thang alen bằng phương pháp PCR. 
- Phương pháp PCR nhiều cấp (multi-generation amplification) để 
 tạo thang alen: 
 + Đối với mỗi locus, sau khi tinh sạch các alen, chúng tôi tiến 
 hành phối trộn các alen theo tỷ lệ thể tích như nhau và thực 
 hiện PCR sử dụng mồi đặc hiệu của locus đó theo chu trình 
 nhiệt đã tối ưu. Đây là thang alen thế hệ I. 
 + Sử dụng thang alen thế hệ I pha loãng thành các nồng độ 
 1/1.000; 1/5.000 và 1/10.000. Tiếp tục PCR sử dụng 1 l sản 
 phẩm pha loãng làm khuôn, thu được thang alen thế hệ II. 
 + Sử dụng thang alen thế hệ II tương ứng với khuôn pha loãng 
 1/10.000 để pha loãng thành các nồng độ tương tự trên và 
 thực hiện PCR, thu được thang alen thế hệ III. 
- Phương pháp xác định trình tự các nucletotide 
- Phương pháp khảo sát tần suất alen và xử lý số liệu bằng các chỉ 
 số thống kê 
 7 
 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1.THIÕT KÕ MåI Vµ Tèi •u PCR phøc 4 locus 
F13A01, D8S1179, Amelogenin, HPRTB (FDAH) 
 3.1.1. Kết quả thiết kế mồi : 
 Sử dụng phần mềm Primer Premier chúng tôi đã thiết kế được 
các cặp mồi đặc hiệu để sử dụng nhân bội đồng thời 4 locus : 
F13A01, D8S1179, Amelogenin và HPRTB (bảng 3.1) 
 B¶ng 3.1. Tr×nh tù vµ th«ng sè c¸c cÆp måi 
 cña 4 locus F13A01, D8S1179, HPRTB vµ Amelogenin 
 Kích 
 Loại Tm thước sản 
 Locus Trình tự mồi 0
 mồi ( C) phẩm 
 PCR (bp) 
 F 5’ - AGC CCC AAG GAA GAT GAG T- 3’ 55.8 279 - 335 
 F13A01 (alen 3 - 
 R 5’ - GGC ATG CAC CTG TAG TTC CA- 3’ 59.0 
 17) 
 F 5’ - GCC AGA AAC CTC TGT AGC CA- 3’ 57.7 227 - 271 
D8S1179 (alen 9 - 
 R 5’ - ATC GTA TCC CAT TGC GTG AA- 3’ 58.7 
 20) 
 F 5'- ACC TCA TCC TGG GCA CCC TGG-3' 
Amelogenin 212- 218 
 R 5'- AGG CTT GAG GCC AAC CAT CAG -3' 
 F 5’ - TTC CAT CTC TGT CTC CAT CTT TG - 3’ 58.6 159 - 203 
 HPRTB (alen 7 - 
 R 5’ - ACA CAT CCC CAT TCC TGC C - 3’ 59.9 
 18) 
 Sản phẩm PCR nhân bội của mỗi cặp mồi đã được kiểm tra kích 
thước phù hợp và tính đặc hiệu qua kết quả điện di trên gel agarose 
(hình 3.1) 
 8 
 1 2 M 3 4 M ĐC 5 6 M50 7 8 M50 ĐC 
 50 50 (-) 
 (-) 
 250bp 200bp 
 (M50: marker 50bp; Giếng 1, 2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi locus F13A01; 
 Giếng 3, 4: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi locus D8S1179; Giếng 5, 6: Sản phẩm 
 PCR sử dụng cặp mồi locus Amelogenin; Giếng 7, 8: Sản phẩm PCR sử dụng cặp 
 mồi locus HPRTB; ĐC(-):mẫu đối chứng âm) 
Hình 3.1. Kết quả PCR kiểm tra cặp mồi 4 locus F13A01, D8S1179, 
 Amelogenin và HPRTB 
 3.1.2. Kết quả tối ƣu phản ứng PCR phức 4 locus: 
 Các cặp mồi đã được sử dụng để tối ưu phản ứng PCR phức 
(multiplex PCR) và sản phẩm PCR được điện di trên gel 
polyacrylamide biến tính. Kết quả thu được như sau: 
 * KÕt qu¶ tèi •u thµnh phÇn PCR cho phøc 4 locus FDAH 
 dNTP: 400 M; MgCl2 : 2 mM; §Öm ph¶n øng: 2X; ADN khu«n: 
2 ng; Taq ADN-polymerase : 2 U; Nång ®é måi F13A01 : D8S1179 : 
AME : HPRTB là 0,8M : 0,8M : 0,4M : 0,8M 
 * KÕt qu¶ tèi •u chu tr×nh nhiÖt cho ph¶n øng PCR phøc 4 
locus FDAH: 95oC - 5 phót (1 chu kú); 94oC- 1 phót; 60oC - 1 phót; 
72oC - 1 phót (35 chu kú); 72oC - 10 phót (1 chu kú). 
 3.2. ChÕ t¹o thang alen 4 locus F13A01, D8S1179, 
Amelogenin, HPRTB (FDAH) 
 3.2.1. KÕt qu¶ chÕ t¹o thang alen locus F13A01 
 9 
 Chóng t«i ®· lùa chän ®•îc 6 alen : ®ã lµ alen sè 3.2; 4; 5; 6; 7 
vµ 8. Kích thước và số đoạn lặp của các alen được xác định căn cứ 
vào mẫu K562 có kiểu gen dị hợp tử 4-5 và kết quả giải trình tự của 
03 alen 3.2; 4 và 8. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù cña chóng t«i phï hîp 
víi c¸c tµi liÖu ®· c«ng bè. 
 6 alen ®· lùa chän tõ locus F13A01 ®•îc tinh s¹ch vµ kÕt hîp 
nh©n béi trong cïngph¶n øng PCR. 
 KÕt qu¶ nh©n béi (h×nh 3.2) cho thÊy: Thang alen c¸c thÕ hÖ 
(nh©n béi ë c¸c nång ®é pha lo·ng kh¸c nhau) ®Òu cã chÊt l•îng nh• 
nhau, thÓ hiÖn ë c¸c b¨ng ph©n t¸ch râ trªn b¶n gel ®iÖn di. 
 M20 1 ĐC 2 3 4 ĐC 5 6 7 ĐC K562 
 (-) (-) (-)
 300bp 
 Alen 5 
 Alen 4 
 280bp 
 H×nh 3.2. KÕt qu¶ chÕ t¹o thang alen cho locus F13A01 
 (Giếng 1: Thang alen thế hệ I; Giếng 2, 3, 4: Thang alen thế hệ II; 
Giếng 5 6, 7: Thang alen thế hệ III . ĐC (-): mẫu đối chứng âm PCR. 
 M20: marker 20bp) 
 3.2.2. KÕt qu¶ chÕ t¹o thang alen locus D8S1179 
 Chóng t«i ®· lùa chän ®•îc 10 alen : ®ã lµ alen sè 9; 10; 11; 12; 
13; 14; 15; 16; 17; 18. Kích thước và số đoạn lặp của các alen được 
xác định căn cứ vào mẫu K562 có kiểu gen đồng hợp tử 12-12 và kết 
quả giải trình tự của 02 alen : alen số 9 và alen số 13. KÕt qu¶ x¸c 
®Þnh tr×nh tù cña chóng t«i phï hîp víi c¸c tµi liÖu ®· c«ng bè. 
 10