Tóm tắt Luận án Nghiên cứu biến đổi của một số gen ty thể ở Bệnh ung thư vú

 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI 
 TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 
 Nguyễn Thị Tú Linh 
NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CỦA MỘT SỐ GEN TY THỂ Ở 
 BỆNH UNG THƢ VÚ 
 Chuyên ngành: Nhân chủng học 
 Mã số: 62310302 
 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
 Hà Nội - 2016 
 Công trình đƣợc hoàn thành tại: 
Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại 
 học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội 
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trịnh Hồng Thái 
 PGS. TS. Tạ Văn Tờ 
 Phản biện: 
 Phản biện: 
 Phản biện: 
 Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc 
gia chấm luận án tiến sĩ họp tại 
 vào hồi: giờ ngày tháng năm 20.. 
Có thể tìm hiểu luận án tại: 
 - Thư viện Quốc gia Việt Nam 
 - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội 
 MỞ ĐẦU 
 Ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân gây 
tử vong hàng đầu trong các loại ung thư ở nữ giới (Globocan 2012), 
tuy nhiên, tỉ lệ sống sót có thể được cải thiện nếu bệnh nhân được 
chẩn đoán ở giai đoạn sớm của bệnh (Anderson, 2008). Đối với sàng 
lọc và chẩn đoán sớm ung thư vú, chụp nhũ ảnh và thăm khám vú 
vẫn là phương pháp chuẩn trong lâm sàng (Vahabi, 2003), tuy nhiên 
nguy cơ phát hiện dương tính giả cao (Elmore, 2010). Điều này cho 
thấy cần phải có các chỉ thị sinh học đặc hiệu đối với sàng lọc và 
phát hiện sớm bệnh. 
 ADN ty thể từ lâu đã được cho là có mối liên quan với quá trình 
phát sinh ung thư vú (Carew, 2002), trong đó có sự thay đổi về số 
lượng bản sao, biến đổi mức độ biểu hiện và hoạt động của các tiểu 
đơn vị của chuỗi hô hấp và các đột biến điểm của ADN ty thể 
(Tseng, 2006; Fan, 2009). Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu trên các 
nhóm bệnh nhân khác nhau vẫn còn gây tranh cãi. Trên đối tượng 
bệnh nhân người Việt Nam, nghiên cứu về về biến đổi của các gen ty 
thể còn ít và chưa có tính hệ thống. Xuất phát từ thực tế trên, chúng 
tôi đã tiến hành chọn đề tài: “Nghiên cứu biến đổi của một số gen ty 
thể ở bệnh ung thư vú” nhằm mục tiêu sau: (1) Cung cấp dữ liệu có 
tính hệ thống ban đầu về biến đổi của một số gen ty thể, bao gồm 
biến đổi số bản sao ADN ty thể, mức độ mất đoạn lớn, biến đổi của 
gen ATP6, tARN, ND1 và ND3, trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú 
người Việt Nam; (2) Xác định được mối liên quan giữa các biến đổi 
này với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú. Kết quả thu được của 
luận án là tiền đề có thể phát triển để sử dụng trong đánh giá nguy 
cơ, hỗ trợ chẩn đoán cũng như tiên lượng bệnh. 
 1 
 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƢ VÚ 
1.1.1. Tình hình mắc ung thƣ vú trên thế giới và ở Việt Nam 
 Trong các loại ung thư ở nữ giới, ung thư vú là dạng ung thư 
phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế 
giới cũng như tại Việt Nam (Globocan, 2012; Duc, 2010). 
1.1.2. Các yếu tố nguy cơ gây ung thƣ vú 
 Các yếu tố nguy cơ được cho là nguyên nhân gây ung thư vú 
bao gồm phóng xạ ion hóa, virus, các hóa chất gây ung thư, chế độ 
ăn uống, hoạt động thể chất, hormone ngoại sinh và một số yếu tố 
sinh sản ở nữ giới. Các yếu tố này gây đột biến các gen tiền ung thư 
hoặc gen ức chế ung thư, từ đó gây ra sự mất ổn định của tế bào 
trong sửa chữa các lỗi di truyền và dẫn đến hoạt hóa các gen gây ung 
thư. 
1.1.3. Các giai đoạn của ung thƣ vú 
 Đánh giá giai đoạn của ung thư vú dựa vào hệ thống phân loại 
TNM, trong đó dựa vào kích thước và mức độ lan rộng của khối u 
thể hiện qua 3 yếu tố: T (Tumor) – u nguyên phát, N (Node) – hạch 
tại vùng và M (Metastase) – di căn xa (Edge, 2010). 
1.1.4. Các chỉ thị sinh học của ung thƣ vú 
 Các chỉ thị sinh học hiện nay của ung thư vú được áp dụng chủ 
yếu cho chẩn đoán, lựa chọn phương pháp và theo dõi điều trị 
(Ludwig, 2005). Thăm khám vú và chụp nhũ ảnh là phương pháp 
chuẩn trong sàng lọc và chẩn đoán sớm, tuy nhiên lại có tỉ lệ phát 
hiện dương tính giả cao (Vahabi, 2003; Elmore, 2010). Do đó, cần 
 2 
phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học đặc hiệu sử dụng trong sàng lọc và 
phát hiện sớm bệnh. 
1.2. TỔNG QUAN VỀ ADN TY THỂ NGƢỜI 
 ADN ty thể là phân tử mạch vòng, bao gồm 16.569 bp, chứa 37 
gen mã hóa cho 13 protein của phức hệ phosphoryl hóa oxi hóa 
(OXPHOS), 22 tARN và 2 rARN. 
1.3. BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ 
 Biến đổi của các gen ty thể được cho là có liên quan với quá 
trình tạo u bởi vì các tế bào ung thư sử dụng con đường OXPHOS ít 
hơn so với tế bào bình thường (Warburg, 1956). Biến đổi này bao 
gồm: thay đổi số bản sao ADN ty thể, giảm biểu hiện của các gen ty 
thể hoặc biến đổi hoạt tính enzyme của ty thể và các đột biến soma 
hoặc đột biến dòng mầm của ADN ty thể (Kulawiec, 2008; Brandon, 
2006). 
1.4. MỘT SỐ BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH UNG THƢ 
VÚ 
1.4.1. Biến đổi số bản sao của ADN ty thể 
 Các phân tử ADN ty thể dễ bị tổn thương hơn trong các tế bào 
ung thư, và do đó ty thể thay đổi số lượng bản sao ADN của chúng 
để phản ứng lại với hiện tượng này (Pelicano, 2004). Đối với ung thư 
vú, số bản sao ADN ty thể được cho là giảm ở mô u so với mô không 
ung thư (Tseng, 2006) và có liên quan với độ tuổi, độ mô học, tình 
trạng của thụ thể estrogen và progesteron, kích thước khối u (Yu, 
2007; Fan, 2009; Bai, 2011). Ngược lại, số bản sao ADN ty thể có xu 
hướng tăng trong mẫu máu của các bệnh nhân ung thư vú so với đối 
chứng và được cho là có liên quan với độ tuổi, giai đoạn bệnh (Shen, 
 3 
2009; Lemnrau, 2015). Các kết quả này cho đến nay vẫn còn gây 
tranh cãi và còn nhiều điều vẫn cần được làm sáng tỏ. 
1.4.2. Mất đoạn lớn của ADN ty thể 
 Hệ gen ty thể được đặc trưng bởi một số ít các trình tự lặp đóng 
vai trò là các điểm cắt để tạo ra các mất đoạn lớn của ADN ty thể 
(Dakubo, 2010). Mất đoạn 4977 bp (∆mtDNA4977), dạng biến đổi 
thường gặp nhất, tạo ra phân tử ADN ty thể nhỏ hơn bình thường 
nhưng vẫn có thể sao chép được và được tích lũy với tỉ lệ khác nhau 
ở các mô sau nguyên phân. Trong nghiên cứu của Zhu (2004), 
∆mtDNA4977 được cho là không đặc trưng ở ung thư vú. Ngược lại, 
∆mtDNA4977 được tìm thấy trong 28/60 mẫu mô vú thường (47%) 
trong khi đó chỉ có 3/60 mẫu u (5%) là có mất đoạn này (Tseng, 
2006). Các kết quả thu được vẫn còn nhiều mâu thuẫn, do đó vẫn cần 
phải tiếp tục nghiên cứu để đưa ra được kết luận chính xác hơn. 
1.4.3. Biến đổi của gen ATP6 
 Gen ATP6, nằm từ vị trí 8527 – 9207 trên ADN ty thể, mã hóa 
cho dưới đơn vị a của tiểu phần F0 thuộc phức hệ tổng hợp ATP. 
Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, Sharp (1992) không phát hiện 
thấy có biến đổi nào trên gen ATP6. Tuy nhiên, một số nghiên cứu 
khác lại phát hiện thấy tỉ lệ biến đổi của gen ATP6 trong khoảng từ 
72% – 82,14%, trong đó có một số biến đổi được cho là làm tăng 
nguy cơ mắc ung thư vú (Grzybowska-Szatkowska, 2014a; 
Ghaffarpour, 2014; Thapa, 2016). 
1.4.4. Biến đổi của gen tARN ty thể 
 Đột biến các gen tARN ty thể thường làm suy giảm hoạt tính 
aminoacyl hóa của phân tử tARN, từ đó ảnh hưởng đến quá trình 
tổng hợp và biểu hiện protein và chức năng của các enzyme 
 4 
OXPHOS (Abbott, 2014). Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, 
Grzybowska-Szatkowska (2012) cho rằng 6 biến đổi A15924G, 
A12308G, T7581C, A8348G, T10034C và T10463C đều có mối liên 
quan với ung thư vú. Ngược lại, Meng (2015) cho rằng các biến đổi 
T7581C và A12308G có vai trò tiềm năng trong biểu hiện lâm sàng 
của ung thư vú, còn các biến đổi khác thì không. Có thể thấy hiểu 
biết về vai trò của các biến đổi gen tARN ty thể trên bệnh ung thư vú 
còn rất hạn chế, do đó gây khó khăn trong việc dự đoán tác động đến 
biểu hiệu lâm sàng của bệnh. 
1.4.5. Biến đổi của gen ND3 
 Biến đổi A10398G làm thay đổi trình tự axít amin từ Threonine 
thành Alanine trong sản phẩm của gen ND3 ty thể. Các nghiên cứu 
trước đây đã phân tích mối liên quan giữa biến đổi A10398G và 
nguy cơ mắc ung thư vú, tuy nhiên kết quả thu được cho đến nay còn 
mâu thuẫn và gây nhiều tranh cãi (Canter, 2005; Bai, 2007) 
1.4.6. Biến đổi của gen ND1 
 Gen ND1 của ty thể mã hóa cho một trong 7 tiểu đơn vị của 
phức hệ hô hấp I và là bước đầu tiên trong chuỗi vận chuyển điện tử 
của ty thể. Biến đổi gen ND1 được cho là làm thay đổi cấu trúc và 
chức năng của protein NADH dehydrogenase subunit 1, từ đó thúc 
đẩy quá trình phát sinh khối u. Một số biến đổi của gen ND1 được 
báo cáo có liên quan với ung thư vú như T3398C, T4216C, A3796G 
và được coi như là chỉ thị sinh học mới trong phát hiện sớm ung thư 
vú (Tan, 2002; Grzybowska-Szatkowska, 2014b; Thapa, 2015). 
Ngược lại, nghiên cứu khác lại cho rằng biến đổi của các gen thuộc 
phức hệ V thường gặp hơn so với gen ND1 ở bệnh nhân ung thư vú. 
 5 
Do đó cần tiếp tục tiến hành nghiên cứu biến đổi của gen này trên 
các nhóm đối tượng khác để cho kết quả chính xác hơn. 
1.5. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở VIỆT NAM 
 Tại Việt Nam, các nghiên cứu về biến đổi của gen ty thể trên đối 
tượng bệnh nhân ung thư vú còn ít và chưa có tính hệ thống. Do đó, 
nghiên cứu này được thực hiện với mục đích xác định các biến đổi 
của một số gen ADN ty thể trên bệnh nhân ung thư vú người Việt 
Nam và phân tích mối liên quan với các đặc điểm lâm sàng của bệnh, 
góp phần làm sáng tỏ vai trò của ADN ty thể đối với bệnh ung thư vú 
và cung cấp dữ liệu có tính hệ thống ban đầu cho các nghiên cứu tiếp 
theo nhằm hỗ trợ cho đánh giá nguy cơ, hỗ trợ chẩn đoán cũng như 
tiên lượng bệnh hiệu quả hơn. 
Chƣơng 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. NGUYÊN LIỆU 
2.1.1. Đối tƣợng 
 Mẫu mô u (được lấy tại vị trí khối u) và mô lân cận u (cách vị trí 
có khối u từ 5 – 10 cm) của 102 bệnh nhân ung thư vú; mẫu mô u và 
mô máu của 20 bệnh nhân mắc u xơ vú và mẫu máu của 65 người 
cho máu khỏe mạnh. 
2.1.2. Hóa chất 
 Các hóa chất được mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk) và 
đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử. 
 6 
2.1.3. Thiết bị 
 Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Proteomics và sinh học 
cấu trúc (KLEPT) và Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lý học và Sinh 
học người, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN đều có độ chính xác 
và tin cậy cao. 
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số 
2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô 
 Mẫu mô được tách chiết bằng QIAamp DNA Mini Kit 
(QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất. 
2.2.1.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu 
 Mẫu máu được tách chiết bằng GeneJET Whole Blood Genomic 
DNA Purification Mini Kit theo quy trình của nhà sản xuất. 
2.2.2. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose và 
polyacrylamide 
2.2.3. Khuếch đại đoạn gen quan tâm bằng phƣơng pháp PCR 
2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR 
 Sử dụng ExoSAP-IT (Affymetrix) theo quy trình của nhà sản 
xuất. 
2.2.5. Phân tích PCR-RFLP 
 Các đột biến điểm trong ADN ty thể được phát hiện bằng kỹ 
thuật PCR-RFLP sử dụng các enzyme giới hạn NlaIII, DdeI, Hin6I, 
SatI, FspBI (Thermo Scientific) theo quy trình của nhà sản xuất. 
 7 
2.2.6. Nhân dòng và tách chiết ADN plasmid 
 Nhân dòng bằng vector pJET1.2/blunt Cloning Vector theo kit 
của Fermentas. Tách chiết ADN plasmid sử dụng QIAprepSpin 
Miniprep Kit (Qiagen) và thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất. 
2.2.7. Định lƣợng ADN bằng realtime PCR 
 Định lượng số bản sao và mất đoạn lớn trong ADN ty thể bằng 
phương pháp realtime PCR dựa trên gen HBB đại diện cho ADN 
nhân), gen ND1 (nằm trong vùng ít mất đoạn) và gen ND4 (nằm 
trong vùng hay xảy ra mất đoạn) đại diện cho ADN ty thể. 
 Hiệu suất khuếch đại của phản ứng realtime PCR được xác định 
dựa vào đường chuẩn theo công thức: 
 -1/slope
 % Hiệu suất = (10 – 1) x 100% 
 Trong đó: slope là hệ số góc của đường chuẩn định lượng. 
 Công thức xác định số bản sao tương đối của ADN ty thể là: 
 Số bản sao tƣơng đối của ADN ty thể = 2(Ct HBB – Ct ND1) 
 Mức độ mất đoạn của ADN ty thể được xác định bằng công 
thức: 
 Mức độ mất đoạn = (1 – 2(Ct ND1 – Ct ND4))*100% 
2.2.8. Định lƣợng ADN bằng HPLC 
 Phương pháp HPLC được sử dụng để định lượng số bản sao 
ADN ty thể dựa trên gen ACTB đại diện cho ADN nhân và gen ND1 
đại diện cho ADN ty thể. Tỉ số bản sao của ADN ty thể so với ADN 
nhân được tính toán dựa theo công thức: 
 Số bản sao tƣơng đối của ADN ty thể = k x S1/S2 
 Trong đó: k = 1,235. S1: Diện tích đỉnh sắc ký của sản phẩm 
gen ND1. S2: Diện tích đỉnh sắc ký của sản phẩm gen ACTB 
 8